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阿維菌素（IVM）ELISA檢測試劑盒

使用說明書

一、檢測原理

本試劑盒利用阿維菌素抗體與阿維菌素可產(chǎn)生特異性結(jié)合的性質(zhì)，先在酶標(biāo)板上預(yù)包被抗原，再加入標(biāo)準(zhǔn)品（樣本）和阿維菌素抗體，樣本或標(biāo)準(zhǔn)品中的阿維菌素藥物與固定在酶標(biāo)板上的抗原競爭阿維菌素抗體，后加入底物催化顯色。此時顯色深度與標(biāo)準(zhǔn)品（樣本）中阿維菌素藥物的含量成反比。

二、檢測范圍

本試劑盒是應(yīng)用ELISA技術(shù)研發(fā)的藥物殘留檢測產(chǎn)品，與儀器分析技術(shù)比較，能經(jīng)濟、快速地檢測組織以及液態(tài)奶樣本中的阿維菌素。

三、交叉反應(yīng)率

阿維菌素類……………………………………………100%

伊維菌素………………………………………………25%

埃普菌素………………………………………………10%

多拉菌素………………………………………………6%

四、試劑盒組成

酶標(biāo)板1塊，96孔/板

標(biāo)準(zhǔn)液6瓶（1 mL/瓶）：

0ppb,0.5ppb,1.5 ppb，4.5ppb,13.5ppb,40.5ppb

酶標(biāo)記物稀釋液 ………………………………………7mL

11×酶標(biāo)記物濃縮液………………………………0.7mL

底物液A ………………………………………………7mL

底物液B………………………………………………7mL

終止液…………………………………………………7mL

20×濃縮洗滌液……………………………………30mL

復(fù)溶工作液………………………………50mL

組織樣本處理液……………………………10mL

說明書……………………………………1份

五、使用單位需自備的設(shè)備及試劑

（1）儀器

微孔板酶標(biāo)儀(450 nm/630 nm)

振蕩器

離心機

渦旋儀

粉碎機

電子天平（感量0.01 g）

（2）器材

單道微量移液器：20 μL～200 μL，100 μL~1000 μL

多道微量移液器：30 μL～300 μL

（3）試劑

甲醇、去離子水

六、溶液的配制

樣本前處理需配制：

配液1：洗滌工作液

用去離子水將濃縮洗滌液（20×）按1 : 19體積比進行稀釋，即1份濃縮洗滌液加19份去離子水。

七、樣本前處理方法

樣本處理前須知：

處理任何樣本時，都須注意：

（1）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（2）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必須使用潔凈實驗器具，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

樣本前處理步驟：

組織：

1、 準(zhǔn)確稱取2±0.05g均質(zhì)后的組織樣品于10 mL離心管中；

2、 依次加入2mL甲醇，100μL組織樣本處理液，充分渦動5 min使樣本分散；

3、 室溫下（25±2℃），4000 g離心10 min；

4、 取200μL上清液加入400μL復(fù)溶工作液中，渦動10s混勻；

5、 取50 μL用于分析。

原奶：

1、 取1mL液態(tài)奶于10 mL離心管中；

2、 加入3mL甲醇，充分渦動1 min；

3、 室溫下（25±2℃），4000 g離心10 min；

4、 取200μL上清液加入400μL復(fù)溶工作液中，渦動10s混勻；

5、 取50 μL用于分析。

八、酶聯(lián)免疫檢測步驟

測定前須知：

1、使用之前將所有試劑和需用微孔板回升至室溫。

2、使用之后立即將所有試劑放回2~8 ℃。

3、在使用中不要讓微孔干燥。 

4、在ELISA分析中的重復(fù)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

5、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

測定步驟：

1、將所需試劑和微孔板從冷藏環(huán)境中取出，在室溫下平衡30 min，每種液體使用前均須搖勻。注意標(biāo)準(zhǔn)液均需做2個平行試驗。

2、酶標(biāo)記物工作液：取1份11×酶標(biāo)記物濃縮液加10份酶標(biāo)記物稀釋液按照1:10的比例稀釋即得。

3、加標(biāo)準(zhǔn)品：加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 mL/孔到對應(yīng)的微孔中，加入酶標(biāo)記物50 mL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光反應(yīng)30 min。

4、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加洗滌液 300μL/孔，每次浸泡15~30 s，充分洗滌4~5次，用吸水紙拍干。

5、顯色：加入底物液A液50 mL/孔，再加底物液B液50 mL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15 min。

6、測定：每孔各加50 μL終止液，設(shè)定酶標(biāo)儀在450 nm處，測定OD值（建議用450/630 nm雙波長檢測，在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)）。

九、結(jié)果分析

所測得的標(biāo)準(zhǔn)液或樣品吸光度的平均值（B）除以DI一個標(biāo)準(zhǔn)液（0標(biāo)準(zhǔn)液）的吸光度（B₀）值再乘以100%，得到百分吸光度值。

百分吸光度值（%）＝

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的10為底的對數(shù)為X軸， 百分吸光值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣本的百分吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的值，作為10的冪，乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中所含阿維菌素的量。

利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準(zhǔn)確、快速分析。

九、樣本稀釋倍數(shù)

組織： 6倍

液態(tài)奶： 10倍

十、試劑盒靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度

試劑盒靈敏度：0.5ppb

樣本低檢測限：

組織……………………………………4 ppb

液體奶…………………………………5 ppb

回收率：90%±30%

精密度：試劑盒的變異系數(shù)均小于10%

十一、注意事項

1、室溫低于20 ℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20~25 ℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象，所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

3、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚；若不慎滴漏到皮膚上，請盡快用水沖洗。

4、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

5、保存試劑盒于2~8 ℃，不要冷凍，將不用的微孔板放進自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

6、顯色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之；0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450 nm）值小于0.5（A_450nm< 0.5）時，表示試劑可能變質(zhì)。

7、在加入底物液后，一般顯色15 min即可。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時間到20 min（或更長），但不得超過30 min；反之，則減短反應(yīng)時間。

8、該試劑盒zui佳反應(yīng)溫度為25 ℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

十二、貯藏條件及保存期

貯藏條件：在2~8 ℃保存試劑盒。

保存期：本試劑盒有效期為12個月。