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ELISA試劑盒酶有HRP、AP兩種酶。它們的底物和化學(xué)反應(yīng)如下：
1.HRP的底物
HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng)，代表性的過氧化物為H2O2，其反應(yīng)式如下：
DH2+H2O2D+H2O
上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測(cè)定。常用的供氫體有鄰苯二胺（O-phenylenediamine,OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB）和ABTS[2,2-azino-di-（3-ethylbenziazobinesulfonate-6）]。
OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有zui高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物zui常用的底物。OPD本身難溶于水，OPD·2HCL為水溶性。曾有報(bào)道OPD有致異變性，操作時(shí)應(yīng)予注意。OPD見光易變質(zhì)，與過氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時(shí)用蒸餾水稀釋。先進(jìn)的ELISA試劑盒中則直接配成含保護(hù)劑的工作濃度為0.02%H2O2的應(yīng)用液,只需加入OPD后即可作為底物應(yīng)用液。
TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色，目視對(duì)比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無致癌性等優(yōu)點(diǎn)，因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反應(yīng)用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，zui適吸收波長(zhǎng)為405nm。
ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。
另一種HRP的底物為3-（4-羥基）苯丙酸[3-（4-hydroxy）phenlypropionicacid,HPPA]，經(jīng)HRP作用后，產(chǎn)物顯熒光，可用熒光光度計(jì)測(cè)量。用于ELISA的優(yōu)點(diǎn)為可加寬定量測(cè)定的線性范圍。
HRP對(duì)氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物（ureaperoxide）。H2O2應(yīng)用zui多，但尿素過氧化物為固體，作為試劑較H2O2方便、穩(wěn)定。試劑盒供應(yīng)尿素過氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉、低溫（2～8℃）可穩(wěn)定1年。
2.AP的底物：
AP為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate,p-NPP）作為底物，可制成片劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm波長(zhǎng)處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。
AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測(cè)定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。
